小羅開講 | 數(shù)字PCR之“分”而治之納米微孔對dPCR定量結(jié)果的影響

首先需要明確納米微孔的數(shù)量

是如何影響dPCR的定量結(jié)果。

dPCR采用直接計數(shù)的方法進行定量分析，即在PCR擴增結(jié)束后，將有熒光信號的納米微孔記為1，無熒光信號記為0（定量是二進制的，因此稱為“數(shù)字"）。有熒光信號的微孔說明至少含有一個拷貝的目標分子。在目標DNA濃度極低的情況下，理論上可以認為有熒光的納米微孔數(shù)目就等于DNA分子的拷貝數(shù)，但通常情況下，數(shù)字PCR的納米微孔中可能會包含兩個甚至更多的目標分子，因此需要采用泊松概率分布公式來進行計算：

λ = ?ln (1 ??p)

λ：每個微孔的目標分子的平均數(shù)量

p：具有正信號的納米微孔數(shù)量與微孔總數(shù)的比值。

可以使用λ計算出目標分子的絕對數(shù)量【2】，很明顯，微孔數(shù)越多，檢測的動態(tài)范圍就越廣【3】。

圖1的泊松概率分布曲線圖更直觀地體現(xiàn)了這一點：

如圖1顯示，隨著陽性微孔比例（p）的增加，體系中目標分子的平均拷貝數(shù)會有較大的差距，隨著p的持續(xù)增加，dPCR結(jié)果的不確定度也隨著提高?？傮w來說，dPCR陽性微孔數(shù)量不得超過總微孔數(shù)量的80%，總反應(yīng)微孔數(shù)的增加提高的是dPCR檢測的線性范圍。

在傳統(tǒng)模擬分析中，測量的不確定度通常受檢測儀器分辨率的限制，例如，熒光檢測器分辨熒光信號微小差異的能力。但在dPCR 檢測中，檢測儀器只需要識別每個納米微孔是否有0個或大于1個目標分子，因此dPCR的數(shù)據(jù)分析較少依賴于檢測器的特性。排除了檢測器對dPCR定量結(jié)果的影響，那么下一個需要明確的信息是什么呢？

需要明確的是

引起dPCR偏差的來源有哪些。

dPCR主要有2個引起偏差的來源，分別是：二次采樣誤差和分區(qū)誤差。二次采樣過程引入了不可避免的誤差源，尤其是當原始樣本中要檢測的目標很少時，設(shè)定了檢測下限，儀器本身能兼容的二次采樣體積越大，一定程度上能提高檢測的靈敏度。

根據(jù)泊松分布原理，陽性微孔比例不超過80%，所以分區(qū)誤差在原始樣本濃度較高的情況下占主導地位。在一組重復實驗中，若信號為0的微孔數(shù)量存在差異，該差異會引起總反應(yīng)體系中目標結(jié)果計算的差異。根據(jù) Dube 等人的分析，可以找到對分區(qū)誤差的計算方式【4】【5】，根據(jù)該計算方式我們可以比較不同納米微孔數(shù)量下的分區(qū)誤差【6】。

圖2比較了20,000個微孔和1,000,000個微孔的二次采樣和分區(qū)誤差與樣本濃度的關(guān)系。在dPCR中，通常將每個納米微孔中的模板拷貝數(shù)λ的范圍調(diào)整到0.001到6【4】（在某些情況下，可以高達8【7】）。在納米微孔N為1,000,000時，分區(qū)錯誤顯著下降到<3%，說明微孔數(shù)量越多，越能降低分區(qū)誤差，從而提高dPCR的檢測準確度。

圖2 . ( A ) 20,000 個分區(qū)和 ( B ) 1,000,000個微孔的

二次采樣和分區(qū)誤差與樣本濃度的關(guān)系

（圖片來源：羅氏診斷整理）

由dPCR定量的原理分析得出，“分"成的納米微孔數(shù)量與定量結(jié)果的準確性和檢測范圍緊密相關(guān)，總結(jié)下來就是：微孔越多，dPCR結(jié)果越準確，動態(tài)范圍越廣。