數(shù)字PCR之“分”而治之微孔反應(yīng)體積穩(wěn)定性對DPCR定量結(jié)果的影響

轉(zhuǎn)自羅氏診斷生命科學(xué)公眾號

大家好，本堂課我們繼續(xù)分析“分"而治之，談?wù)勎⒎磻?yīng)體積的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性對dPCR定量結(jié)果的影響。

如圖1所示，當(dāng)微反應(yīng)體積存在差異，而這種差異又被忽略的情況下，p值會偏低，導(dǎo)致dPCR的結(jié)果也偏低，尤其在整個反應(yīng)體積中模板濃度比較高的情況下，影響更大；反之當(dāng)原反應(yīng)體系中模板濃度足夠低，或者有足夠的微反應(yīng)數(shù)量能 每個納米孔的單分子占有率，微反應(yīng)體積偏差可以被忽略【3】。由此得知，微反應(yīng)體積是影響dPCR檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的又一重要因素。

首先要選擇更穩(wěn)定的分區(qū)方式。

微反應(yīng)的形成主要有以下兩種方式：微滴式dPCR（ddPCR）和芯片式dPCR（dPCR）。

微滴式dPCR是將兩種互不相溶的液體的其中一種作為連續(xù)相（油），另外一種作為分散相（水），在水/油兩相表面張力和剪切力共同作用下分散相以微小體積單元的形式存在于連續(xù)相中，從而生成液滴實現(xiàn)多單元獨 擴增。這種方式具有成本低，容易實現(xiàn)的優(yōu)點，在早期推出的dPCR平臺上被廣泛應(yīng)用。但這種方式的局限性就在于微滴的均一性以及微滴之間的相互干擾直接影響微反應(yīng)單元的數(shù)量以及微滴體積的準(zhǔn)確判斷，即使是同類型的微滴發(fā)生器之間形成的微滴體積也會存在明顯差異【4】【5】。如果在分析的過程默認(rèn)微滴體積是個固定值，微滴式dPCR 定量結(jié)果與使用真實微滴體積計算的濃度之前有明顯差異【2】。



芯片式dPCR是通過芯片設(shè)計將納升液體封閉在高通量的微孔或微量通道中進行后續(xù)的PCR擴增及擴增后結(jié)果的熒光判讀。芯片式dPCR生成的反應(yīng)微孔是物理分區(qū)，體積均一，具有較高的穩(wěn)定性，體系之間影響較小， dPCR定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。



但上述兩種分區(qū)方式不論哪一種，微孔反應(yīng)體積的偏差都不容忽視【6】【7】，因為樣品的前處理方法、檢測反應(yīng)的體系等因素都會引起微孔反應(yīng)體積的差異。



因此， dPCR檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性的第二要素是監(jiān)控及校準(zhǔn)微反應(yīng)體積。

納米微孔的體積是影響dPCR檢測結(jié)果的一個關(guān)鍵因素，選擇合適的微反應(yīng)形成方式可以降低微反應(yīng)體積的偏差。但無論選擇哪種方式，實現(xiàn)對微反應(yīng)體積的監(jiān)測及校準(zhǔn)是 dPCR檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素。因此，dPCR平臺自帶微反應(yīng)體積監(jiān)測及校準(zhǔn)功能，才能有效把控微反應(yīng)體積對檢測結(jié)果的影響，從而 檢測的結(jié)果不受微孔體積偏差的影響。



dPCR技術(shù)優(yōu)勢已不需要再贅述，面對目前市場上眾多的平臺選擇，如何去篩選適合自身應(yīng)用的dPCR平臺是關(guān)鍵。

參考文獻：

1. Standardization of nucleic acid tests for clinical measurements of bacteria and viruses. J Clin Microbiol. 2015; 53: 2008–14.

2. Droplet volume variability as a critical factor for accuracy of absolute quantification using droplet digital PCR. Analytical and Bioanalytical Chemistry volume 409, 2017; 6689–6697

3. Considerations for Digital PCR as an Accurate Molecular Diagnostic Tool Clin Chem, Volume 61, Issue 1, 1 January 2015; 79–88.

4. DNA copy number concentration measured by digital and droplet digital quantitative PCR using certified reference materials. Anal Bioanal Chem. 2015; 407:1831–40.

5. Method for measuring the volume of nominally 100 μm diameter spherical water-in-oil emulsion droplets. NIST Spec Publ. 2016; 260-184.

6. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Anal Chem 2012; 84:1003–11.

7. Single molecule detection in nanofluidic digital array enables accurate measurement of DNA copy number. Anal Bioanal Chem 2009; 394:457– 67.