小羅開講 | 數(shù)字PCR之“死體積”對定量結(jié)果的影響

轉(zhuǎn)自：羅氏診斷生命科學(xué)微信公眾號

什么是dPCR系統(tǒng)的死體積？

預(yù)反應(yīng)體積與反應(yīng)體積之差稱為死體積（dead volume）^【1】，其中預(yù)反應(yīng)體積是指分區(qū)之前準備的初始體積，包括master mix、引物、探針以及待檢測樣本；反應(yīng)體積是指被檢測到的分區(qū)總體積n×Vp，n為分區(qū)總數(shù)，Vp為分區(qū)體積。

死體積一般是在分區(qū)過程中產(chǎn)生，如制備過程移液步驟過多、復(fù)雜管路設(shè)計、分區(qū)過程的擠壓設(shè)計、分區(qū)后的穩(wěn)定性等，有一些儀器的檢測過程也會降低樣品的利用率。

任何生物分析都存在二次抽樣誤差，只有部分樣品被分析而不是全部，導(dǎo)致重復(fù)檢測之間的統(tǒng)計差異。例如血液樣本處理量可以達到幾毫升，而dPCR檢測體系一般只有幾十微升。二次抽樣是一個不可避免的誤差來源，尤其是在樣品中目標分子很少的情況下。由二次抽樣引起的檢測誤差可以由以下公式（1）進行計算^【2】，其中m是二次取樣中目標分子的數(shù)量，對于95%的置信度，Zc應(yīng)為1.96。

死體積的存在導(dǎo)致dPCR運行過程中對樣品進行再次抽樣，其引起檢測結(jié)果的影響可參考二次抽樣誤差計算。A. Lievens等人也模擬了不同樣品利用率和各種λ值的情況下再次抽樣對結(jié)果誤差的影響^【3】。

圖1 樣本利用率與檢測誤差率的關(guān)系

圖片來源：羅氏診斷整理

圖1縱坐標表示誤差超過25%的結(jié)果比例，橫坐標表示用于分析的樣本比例，圖1的A中：藍色表示目的基因λ=0.003，紅色表示目的基因λ=0.015，黃色表示目的基因λ=0.03；圖1的B中：藍色為目的基因λ=0.001，紅色為目的基因λ=0.005，黃色為目的基因λ=0.01。結(jié)果表明絕對誤差超過25%的結(jié)果比例與樣品利用率成負相關(guān)，既死體積越大，出現(xiàn)誤差偏高的機率越大。

從一個簡單的例子可以進一步解釋死體積對dPCR檢測結(jié)果，尤其是低拷貝模板的檢出率的影響。

如圖2^【4】所示：在不存在死體積的情況下，樣本拷貝數(shù)為15，分區(qū)數(shù)量為15。如死體積率為5%，有效分區(qū)數(shù)約為14~15，樣品檢出率在12~15拷貝之間；如死體積率為25%，有效分區(qū)在11~12，樣品檢出率在4-15拷貝；死體積率為50%，則有效分區(qū)數(shù)為7~8，樣品檢出率為2~13拷貝。死體積率越高，檢測結(jié)果的穩(wěn)定性越低，檢出限（LOD）也隨之降低，這一效應(yīng)在低拷貝樣品中尤其明顯。

圖2 dPCR分區(qū)

圖片來源：Journal of Food Protection, Vol. 74, No. 9, 2011, Pages 1404–1412.

與qPCR相比，dPCR檢測過程需要經(jīng)過分區(qū)這個過程，死體積率的出現(xiàn)不可避免，但死體積率與檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和檢出限成負相關(guān)，尤其是在檢測低拷貝樣品時需要重點關(guān)注dPCR系統(tǒng)的死體積率，盡可能選擇死體積率低的系統(tǒng)，以保證結(jié)果的準確性。

參考文獻：

【1】Clinical Chemistry, Volume 66, Issue 8, August 2020, Pages 1012–1029 ；

【2】SLAS Technology, Volume 22, Issue 4, August 2017, Pages 369-386 ;

【3】PLoS One, Volume 11, Issue 5, May 2016 ;

【4】Journal of Food Protection, Vol. 74, No. 9, 2011, Pages 1404–1412.

* MC-CN-02328 有效期至2025年8月5日

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